　酵母形質転換　　　　　　　　　　　

One-Step Yeast Transformation

One-Step Buffer

60% PEG	667	333	67
4M LiAc	50	25	5
1M DTT	100	50	10
Water	183	92	18
Total	1000	500	100

PEG: Polyethylene glycol 4000 (Autoclave)

LiAc: Lithium acetate (Autoclave)

DTT: Dithiothreitol (Filtration, Store at –20ºC)

Freshly prepare more than 100 µl One-Step buffer for 1 transformation

Carrier RNA or heat-denatured carrier DNA (10 mg/ml)

Yeast culture

1) Liquid YPD culture: 2 ml YPD for one transformation, 24 hr

2) YPD plate culture: Spread cell suspension on a plate and grow for 24 hr

We prefer plate culture.

Method

Transfer yeast liquid culture to a microtube

Centrifuge at 12000 rpm for 5 sec

Discard supernatant

Add 50 µl One-step buffer to the cell pellet. Go to Step 2

Step 1. Take 50 µl One-step buffer in a microtube

Transfer cells grown on a plate to the tube with a toothpick or a spatula

(approx. 10-20 µl volume per 50 µl. Much is better)

Step 2. Voltex or mix by pipetting. Centrifuge 12000 rpm for 5 sec.

Step 3. Take out the supernatant by pipetman

Step 4. Add 50 µl One-step buffer, 5µl carrier RNA and 1-5 µl DNA

Step 5. Mix by pipetting or voltex

Step 6: Incubate at 42ºC for 1-3 hr depending on yeast strains and its growth phase (Usually 1 hr)

Step 7: Add 150 µl sterile water and spread on a selection plate

Incubate for 2-3 days

　酵母の形質転換法に関する論文は多い。Liによる形質転換が発見されてから(Ito et al., 1983)，様々なパラメターが検討され，様々な変更が加えられた。私たちは，ほぼすべてのパラメターを扱い，最も簡単で最も効率よい方法を探している。私の経験からみた価値ある論文を３つ紹介します。

Chen D, Yang B, Kuo T. 1992. One-step transformation of yeast in stationary phase. Curr Genet 21: 83-84.
　Yeast transformationの論文でもっともっと評価されてよい方法です。DTTの効果は絶大です。Heat shockの効果もみており，素晴らしい方法なのにあまり知られていないようです。私たちの方法の基本部分はこの論文からです。
Schiestl RH, Gietz RD. 1989. High efficiency transformation of intact yeast cells using single stranded nucleic acids as a carrier. Curr Genet 16: 339-346.
Single stranded DNAやRNAの効果をみた最初の論文となると思います。E. coliのアルカリ-SDSサンプルDNAがより精製したCsClのDNAよりも形質転換効率がよいことは気づいていたのですが，それが一本鎖核酸のせいだと教えてくれたのがこの論文です。この効果も絶大です。でもなぜなんでしょうか。形質転換の機構の解明は未知の部分が多いのです。
Elble R. 1992. A simple and efficient procedure for transformation on yeasts. BioTechniques 13: 18-20.
最もシンプルな方法で行うきっかけを与えてくれたのがこの方法です。今ではこの方法は使いませんが，一晩インキュベートするという方法をやってみているのが私の好みで，たぶんまき忘れたチューブをまいてみたのではと想像しています。この論文きっかけに，私たちの42℃の重要性を示した論文(Akada et al., BioTechniques 28: 854-856, 2000)が生まれています。

　これらの論文や，他の論文，さらに，私たちいじった様々なパラメター（ネガティブな結果が大量にあります）から現在もっとも効率よい最も簡単な方法が現在の私たちの方法です。まだ改良できると思っています。